蛍光顕微鏡は、研究者が細胞や組織内の特定の分子や構造を視覚化できる強力な技術です。蛍光顕微鏡用のサンプルを準備するには、凍結組織の薄い切片を切断するためにクライオスタット ミクロトームがよく使用されます。このブログ投稿では、クライオスタット ミクロトームのサプライヤーとしての私の経験を活かし、蛍光顕微鏡にクライオスタット ミクロトームを使用する方法についていくつかの洞察を共有します。
クライオスタットミクロトームを理解する
クライオスタットミクロトームは、低温で凍結組織の薄い切片を切断するように設計された特殊な器具です。切断刃、試料ホルダー、温度制御室で構成されています。低温は組織構造を保存し、蛍光分子の劣化を防ぐのに役立ちます。
市場では、さまざまな種類のクライオスタット ミクロトームが入手可能です。たとえば、クリオトーム正確な切断能力を提供しますが、半自動クライオスタット自動化とユーザー制御のバランスが取れています。私たちのクライオスタットミクロトーム先進の機能を組み合わせて研究者の多様なニーズに応えます。
クライオスタットミクロトームの準備
クライオスタットミクロトームを使用する前に、機器を適切に準備することが重要です。まず、切断ブレードと試料ホルダーを清掃して、破片や汚染物質を取り除きます。適切な洗浄液と柔らかいブラシを使用して、徹底的に洗浄してください。
次にクライオスタットチャンバーの温度を設定します。理想的な温度は、切片化される組織の種類によって異なります。一般に、-18°C ～ -25°C の温度がほとんどの組織に適しています。先に進む前に、クライオスタットが設定温度に達するまで待ちます。
組織サンプルの準備
組織サンプル前処理の品質は、蛍光顕微鏡検査を成功させるために非常に重要です。まず、適切な固定液で組織を固定します。蛍光顕微鏡では、蛍光シグナルをよく保存するため、パラホルムアルデヒドなどの固定剤が一般的に使用されます。
固定後、組織は凍結保護される必要があります。これには、凍結中の氷結晶の形成を防ぐために、スクロースなどの凍結保護溶液に組織を浸すことが含まれます。次に組織は、OCT 化合物などの適切な凍結媒体中で凍結されます。
組織を標本ホルダーに取り付ける
組織が凍結したら、標本ホルダーに取り付ける必要があります。凍結組織ブロックを標本ホルダーに慎重に置き、適切な取り付け器具を使用して固定します。正確な切片を確保するために、組織が中心にあり、ホルダーにしっかりと取り付けられていることを確認してください。
断面化パラメータの設定
切片作成プロセスを開始する前に、クライオスタット ミクロトームで切片作成パラメータを設定します。これらのパラメータには、切片の厚さ、切断速度、前進速度が含まれます。切片の厚さは、組織の種類と蛍光顕微鏡実験の要件によって異なります。ほとんどの用途には、5 ～ 10 マイクロメートルの切片厚さが適しています。
切断速度と前進速度は組織の硬さに基づいて調整する必要があります。柔らかい組織はより遅い切断速度とより小さな前進速度を必要とする可能性がありますが、硬い組織はより速い切断速度を許容できます。
組織の切片化
パラメータを設定したら、切断プロセスを開始します。試料ホルダーを切断刃に向かってゆっくりと前進させます。ブレードが組織を切断すると、薄い切片が生成されます。細いブラシまたはセクションリフターを使用して、切片をスライドガラスに慎重に移します。
損傷を避けるために、セクションを優しく扱うことが重要です。セクションがスライド上に均等に配置され、重ならないようにしてください。
切片の蛍光染色
切片を切った後、次のステップは切片を蛍光色素で染色することです。核染色用の DAPI や特定のタンパク質の標識用の Alexa Fluor 色素など、さまざまな用途に利用できるさまざまな蛍光色素があります。
メーカーの指示に従って染色液を調製します。切片を染色液中で適切な時間インキュベートします。染色後は、余分な染料を取り除くために切片をよく洗います。
染色セクションの取り付け
切片を染色したら、カバースリップに取り付ける必要があります。蛍光色素と互換性のある適切な封入剤を使用してください。染色された部分に封入剤を一滴置き、気泡の形成を避けながら慎重にカバーガラスをスライド上に下げます。
セクションの画像化
最後に、染色された切片は蛍光顕微鏡検査の準備が整います。スライドを顕微鏡ステージに置き、焦点と倍率を調整して蛍光シグナルを視覚化します。適切なフィルターを使用して、さまざまな蛍光色素を検出します。
トラブルシューティングとヒント
- セクションの品質: 切断面にしわや破れがある場合は、切断刃の切れ味や損傷がないか確認してください。高品質の切片を製造するには鋭い刃が不可欠です。
- 蛍光信号: 蛍光シグナルが弱い場合は、染色プロトコルを確認してください。染色時間と染料濃度が適切であることを確認してください。また、蛍光シグナルが低下する可能性があるため、切片を洗いすぎないように注意してください。
- 温度制御: 切断プロセス全体を通じて、クライオスタット チャンバー内の温度を安定に維持します。温度の変動はセクションの品質に影響を与える可能性があります。
ご購入・ご相談のお問い合わせ先
蛍光顕微鏡のニーズに合わせてクライオスタット ミクロトームの購入に興味がある場合、またはその使用方法についてご質問がある場合は、お気軽にお問い合わせください。当社の専門家チームは、お客様の研究に最適な機器を見つけるお手伝いをいたします。
参考文献
- 組織学: テキストとアトラス、Michael H. Ross および Wojciech Pawlina 著。
- 蛍光顕微鏡: 原理、技術、および応用、Richard P. Haugland 著。